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人类基因组组装
人类基因组计划在拼接前已经制备了高精度的物理图谱以便于基因组拼接。图谱的制备策略是这样的:从人体中取出的基因组DNA经过限制酶切,得到100000-200000长度的片段,然后将这些片段制成细菌人工染色,插入细菌基因组中。在细菌中,这些DNA片段(即克隆)得到扩增,最终数量达到测序所需的要求。我们把包含全部基因组序列的克隆称作「BAC库」,一个人基因组的BAC库需要大约20000个BNA克隆。
接下来,我们对这些BAC克隆制备「指纹图谱」,即使用某种特定的限制酶剪切得到特有的片段畋谱。比较不同克隆的指纹图谱,就可能找到互相有重叠的克隆(如果克隆之间存在相似的亚片段),从而确定BAC相互的排列次序。这些BAC克隆也被制作成「图谱」,从而可以确定该BAC上的DNA序列来自于人类的哪条染色体。这部分工作是通过寻找每个BAC克隆中的基因组标记而完成。综合所有信息就可以行到一幅基因组物理图谱,通过这个物理图谱可以把每一个克隆序列在染色体上精确定位,还可以确定这个克隆和其他人类DNA的BAC克隆的空间关系。
在测序的时候,每个BAC克隆都会被切得更小,其间的重叠片段大约长2000碱基对。这些克隆被插入到质粒中,然后从质粒克隆的两端分别进行测序反应。整个BNA的序列都是由这些微小的片段拼接而成,先形成较长的序列『重叠群(contig)』,然后得到可以表示整个人类序列(包括一些有疑问的BAC)的单序列重叠群。因为通过物理图谱已经知道了BAC克隆间的规则和重叠关系,所以即便更长的序列也可以类聚到一起。最终,这些重叠群就会集合成整个染色体,以及人类基因组的全部序列。
从测序仪测出的500碱基对的片段拼接出一个3200000000碱基对的基因组是令人难以置信的飞跃,需要巨大的计算能力。然后数据被反馈到一个可以鉴别并合重叠序列的拼接者程序中。
质量控制很明显非常重要。已经开发出了一些软件来监控原始数据的质量,评估基于『base-calling』程序所得出结果的正常性。包含错误和疑问的序列片段在进入拼接程序之前就被清除掉了。 PHRED(读作“Fred”)是为测序仪所读出的序列给出「质量值」的标准程序。而后拼接具有重叠区的序列的标准程序称为PHRAP(读作“Frap”)。这两个程序都是由Phil Green和他在华盛顿大学的同事们共同开发完成的。
虽然拼接程序可以详细审核冲突信息并给出哪段片段可能是正确的,但是最终的拼接和精雕强琢还是要由人来完成。专家们勤恳的鉴定每一个洞和含精部分,并找到补洞和解决分歧的具体实验方法。基因组序列要被读很多遍来确定没有缺失片段和测序仪读错的片段。一些延伸序列容易读通,只需要测极少的几次就可以确定正确序列。但是对于基他一些区域,就需要测很多次来得到一个高质量序列。一个基因组序列被重复阅读的次数被称为“覆盖深度”。
人类基因组计划的目标是产出一个高质量的人类基因组『完成』序列。完成序列的公认标准是任何一个碱基因的正确率是99.99%,就是说每个碱基最多不能有超过一个的错误。为了达到这一目标,每一个碱基因平均要被测序9次(也就是说,要有9倍的覆盖深度)。籽找到所有的基因和它们的调控组合,以及发现不同人类基因组间差异,这一准确度是必需的。
2001年以发表的人类基因组只是一个工作框架图,换句话说,还没有最终完成。工作框架图包括了人类基因组90%的常染色质区,大约2950000000碱基对,其中大部了分的基因已经被发现,这些区域的DNA是一种相对“开放”的构象(基因组中其它称作异染色质的区域,包括中心粒和端粒,处于相对封闭的状态)。工作草图中的每个碱基至少有4-5倍的覆盖率,具有99.9%的准确率。有些区域测了更多次,实际上,在人类基因组公布的时候,大约有1/3的区域已经最终完成了,其中包括两条完整的染色体,即21和22号染色体。工作草图也有许多空洞和模糊的地方。
就像一本书缺了几页,或者像一些字放错顺序或者是放错了页码。那么拼接时是如何产生空洞和错误的?这主要因为一些特殊区域DNA的化学组成全使难于进行克隆和测序。在人类基因组中,有许多的重复区域,这些区尤其难操作。首先,这些重复区不稳定,很难克隆,其次,它们能够干扰DNA聚合酶,影响测序的进行,另外,在序列拼接时候,由于重复区相似的序列结构,常把一个序列弄错成其他序列,使拼接变得复杂起来。
只有填补了所有的洞(在目前技术允许的情况下),人类基因组计划才会最终完成。人类基因组计划的目标是到2003年产生一个完成版本的人类基因组,以此来适时地纪念沃森和克里发出DNA结构50周年。
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